NPGS高梁种质资源中蛋白质含量评估及遗传差异分析

编辑|长歌史说

为了开发营养价值更高的高梁品种，需要确定高蛋白质含量的种质，以扩大育种的遗传多样性。此次研究开发了一种近红外（NIR）光谱法，用于预测全谷物高梁的蛋白质含量，其相关性系数（R2）为0.83，预测的均方根误差为1.44%，偏差为0.16%。

对来自美国国家植物种质系统（NPGS）维护的228个西非和中非热带高梁种质进行了为期三年的蛋白质含量评估。对结果进行分析，不同种质的蛋白质含量在5.05%至15.00%之间变化，平均为10.24%。

蛋白质含量的遗传力较高（H2=0.81），表明观察到的大部分变异可以通过种质之间的遗传差异来确定。具有最高蛋白质含量（12.84%）的16个热带种质可用于育种计划，以开发新的改良营养品种。

高梁（Sorghumbicolor(L.)Moench）是全球第五大重要谷物，仅次于小麦（TriticumaestivumL.）、稻米（OryzasativaL.）、大麦（HordeumvulgareL.）和玉米（ZeamaysL.），被用于人类和动物的食用。

高梁在非洲和印度人民的饮食中具有重要地位，而且如今是一种重要的无麸质替代品。与其他谷物相比，高梁的营养研究有限，因此其全面的营养潜力尚未得到充分发挥。

多项研究发现，高梁的蛋白质含量在4.4%到21.1%之间变化，高梁蛋白质被称为凯菲尔蛋白，属于一类被称为谷蛋白的蛋白质。这类简单蛋白质也存在于其他谷物中，但与玉米的玉米醇（zein）、小麦的麦醇（gliadin）和大麦的大麦醇（hordein）相比，凯菲尔蛋白更亲水疏水性更强。

高梁的蛋白质可消化性较低，特别是在湿煮时，降低了其对人类和动物的营养价值，凯菲尔蛋白与其他蛋白质的行为存在显著差异，这些差异仍需进一步研究，可能对提高高梁的营养价值至关重要。

改善高梁营养价值的新品种的开发应包括蛋白质的可消化性和烹饪过程。与营养相关性状的复杂遗传需要多个高营养源之间的重组才能显著改良。例如，玉米与高籽粒蛋白含量的持续重组在伊利诺伊州的长期选择育种计划中使其增加了27%。

提高高梁的营养价值需要组合多种高蛋白含量和可消化性的变种。高梁是一种高度多样化的热带作物，起源于5000至7000年前的东北非洲。在扩展到其他非洲地区时，作物经过再驯化，形成了五个植物种群，它们具有独特的花序类型和环境适应性。

例如，bicolor、caudatum、durra和guinea种属于非洲的热带地区，大多数这些种属是光周期敏感的（即在短日照条件下开花），而kafir种是在南部非洲温带地区驯化的，大多数其种属是非光周期敏感的（即日中性）。

美国农业部（USDA）的国家植物种质系统（NPGS）保存了全球最大的高梁收藏品，拥有来自114个国家的超过41860个种属。由于大多数种属的光周期敏感性（80%的收藏品）限制了对重要农艺性状的筛选。

仅对NPGS的一部分热带种属进行了营养品质参数的评估，对美洲高梁协会试验群（SAP）中适应温带的种属进行的营养价值评估表明存在蛋白质、脂肪和淀粉的遗传多样性。

埃塞俄比亚、南非、苏丹野生高梁和全球核心收藏品的热带高梁种质中也发现了营养性状的遗传多样性，NPGS的热带高梁种质收藏中可能包含尚未发现的营养性状的有用遗传变异源。开发一种高通量筛选营养性状的系统是挖掘NPGS高梁收藏的第一步。

近红外（NIR）光谱技术是一种无损、快速、低成本的方法，用于测量多个谷物营养性状。NIR仪器通过固定光程测量散射或透射辐射（350至2500纳米）穿过谷物样品或面粉，然后与多个营养性状进行相关分析。

该技术已被用于估计高梁、裸燕麦和小麦的蛋白质含量，相关系数较高（r2≥0.80）。如今，NIR已成为美国粮食和谷物协会批准的谷物和面粉中蛋白质含量估算的官方方法（）。

存在多种仪器和近红外扫描谷物或面粉的方法，每个育种或研究计划都需要校准和验证自己的样本集。识别NPGS热带高梁种属中高蛋白含量的新资源是增加育种计划中营养性状遗传多样性的第一步。

本研究建立了一个可靠的近红外系统，用于测量整粒高梁样品的蛋白质含量，此次评估了来自西非和中非的228个NPGS热带种属样本，历时三年，以发现高蛋白含量的种属。这项工作是对NPGS种属进行更大规模的营养性状筛选的开端，将受益于全球的高梁育种者。

2.1.种子来源

本研究评估了一组来自美国农业部国家植物种质系统（NPGS）高梁核心收藏品的228个西非和中非的热带高梁种质，以及具有高颗粒耐候性和抗霉性的七个育种系列，以及SC112和RTx430。

2.2.实验设计

获取了NPGS高梁种质收藏中有限数量的种子，并于2018年和2020年以完全随机设计方式进行播种。种子增殖自前一次实验的种子被于2022年按照完全随机区组设计方式进行播种，包括两个区组。

所有实验地块的长度为1.8米，行间距为0.9米。每个地块选择3至5个代表性穗进行人工收获，收获时间在授粉后35至40天，干燥以使含水量达到标准化水平，打谷后使用完整种子进行蛋白质含量测定和近红外扫描。

2.3.近红外扫描

2018年、2020年和2022年的高梁谷物样品使用台式ASDLabSpec4（AnalyticalSpectralDevice-ASDInc.,BoulderCO,USA）光谱仪连接到ASD转盘进行扫描，提供53.22毫米的采样点。

约30-50克谷物放置在玻璃培养皿（直径90毫米×深度15毫米）中，并调整平整，使谷物表面到仪器收集光学装置的距离均匀。在扫描前，每个样本/培养皿在ASD转盘上随机旋转，这个过程对每个样本重复进行六次。记录每个扫描样本在350-2500纳米范围内，以5纳米间隔的NIR光谱。

2.3.1.近红外校准蛋白质含量

根据106个高梁谷物样本的光谱和蛋白质浓度完成了近红外蛋白质校准。其中，一组51个谷物样本涵盖了蛋白质含量变化的广泛范围，这些样本由美国农业部谷物和动物健康研究中心（USDA-ARSCenterforGrainandAnimalHealthResearch）提供。

该组样本的蛋白质浓度通过使用LECOFP-528氮测定仪在氮燃烧下确定，按照AACC国际方法46-30.01，采用氮到蛋白质转化系数为6.25。从2018年的实验中随机选取了55个谷物样本。

这些样本的氮含量通过修改的微型克氏法，按照AACC国际方法46-12.01进行测定，将10-20克谷物在70°C下干燥至恒定质量，并使用1毫米筛孔的Wiley磨粉。

每个样本取0.2克高梁粉末的三个重复物在Kjeldahl管中进行2小时消化，消化过程中加入一个催化片（1.5克K2SO4+0.15克CuSO4）、5毫升浓硫酸和3毫升30%过氧化氢。消化样品在KjeltecTM2100蒸馏器中蒸馏，并用滴定以确定总氮含量。

在光谱数据分析之前，对106个高梁谷物样本的950-1650纳米波长范围的近红外光谱数据进行了乘法散射校正和均值中心化处理，使用GramsIQ/软件进行光谱数据分析。

采用部分最小二乘回归模型，使用包含28个样本的子集构建了一个具有19个因子（ProCal-19）的模型，这些样本覆盖了蛋白质浓度的全范围（表1；10.36%±2.51）。

2.4.蛋白质含量和统计分析

使用ProCal-19回归模型预测了来自西非和中非的228个热带高梁种质和参考系列的蛋白质含量。三年的蛋白质数据按照随机区组设计（RCBD）和四个区组（2018年、2020年和2022年的两个重复）进行分析。

在SAS（SASInstitute,Cary,NC,USA）中使用Procmixedcovtestmethod=REML过程进行RCBD方差分析，其中区组（即年份）被视为固定效应，种质作为随机效应。使用最小显著差异检验（LSD）在5%的显著性水平上比较种质和参考系列的平均蛋白质含量。

使用最小显著差异检验（LSD）在5%的显著性水平上比较不同原产国和种子颜色的平均蛋白质含量。使用SAS的Proccorr过程确定了年份间平均蛋白质含量的Spearman相关性。

近红外(NIR)光谱是一种无需研磨种子就能快速测量NPGS热带高梁种质集合中谷物蛋白质含量的经济有效方法。对来自西非和中非的228个高梁种质进行的评估发现，有16个种质在多个年份都表现出较高的蛋白质含量。

这16个种质可以在育种计划中使用，开发具有改善营养特性的新品种。对NPGS高梁种质集合的进一步筛选将有助于发现其他高蛋白质种质，并揭示驯化过程对谷物蛋白质变异的影响。

近红外校准中使用的ProCal-19偏最小二乘回归模型对蛋白质浓度的预测表现最准确，校准样本中的R2为0.98，交叉验证标准误差(SECV)为0.58%。使用ProCal-19对验证集进行的蛋白质浓度预测具有R2=0.83，预测均方根误差(RMSEP)=1.44%和偏差=0.16%。

这些结果验证了ProCal-19回归模型在评估多样化高梁种质种群的蛋白质含量方面的有效性。228个热带种质的平均蛋白质含量（10.24%）高于参考育种系列的平均含量（8.95%）。

参考系列RTx430和6550Sumac的蛋白质含量（7.54%）是最低的。三年的评估发现，有16个热带种质的蛋白质含量超过12.84%。

这16个种质（PI525907、PI586420、PI563345、PI525906、PI525919、PI525910、PI515900、PI585975、PI510953、PI586409、PI560375、PI514590、PI585983、PI585477、PI585795和PI513901）与特定的地理起源无关。

不同原产国和种子颜色之间存在蛋白质含量差异，来自西部地区（马里、多哥、贝宁、塞内加尔、加纳、尼日利亚和布基纳法索）的种质的蛋白质含量（10.39%）高于来自东南部地区（布隆迪、肯尼亚、乌干达和卢旺达）的种质（9.05%）。

马里的种质显示出最高的蛋白质含量，种子颜色的分析显示白色和较浅颜色（白色、浅褐色和浅红色）的种子具有较高的蛋白质含量，而棕色和红色的种子则较低。

在228个种质中，高梁种族分类包括caudatum（30个）、durra（1个）、guinea（85个）、kafir（26个）、种族中间型（76个）和十个未分类的种质。

此次发现guinea种族及其与bicolor、kaffir和caudatum的中间型相结合的种质具有较高的蛋白质含量（10.53%），而caudatum、kafir和与bicolor、caudatum和durra相结合的kafir中间型的蛋白质含量较低（9.81%）。

guinea种族包括16个高蛋白质种质中的12个，这个结果可能表明高梁的重新驯化过程与蛋白质含量之间存在关联。鉴定蛋白质含量高的高梁种质对于开发具有改善营养品质的品种很重要。

蛋白质定量的缓慢、昂贵的筛选方法以及大部分NPGS高梁种质收藏是热带型（即光周期敏感），这阻碍了对重要营养性状的评估。本研究首次使用快速的近红外预测系统对NPGS高梁热带种质的一个子集进行了大规模筛选，并记录了谷物蛋白质含量的广泛遗传变异。

谷物蛋白质含量被认为是一个经过人类选择的驯化性状，高蛋白质等位基因在高梁的土著种和野生天然种群中应该出现频率较低。这些种质中的蛋白质含量范围显示只有少数种质具有高蛋白质含量，大多数种质的表现与育种系列相似。

淀粉，是高梁谷粒的主要成分，与蛋白质含量呈负相关，高梁育种计划已经增加了淀粉谷物的含量，但间接降低了其蛋白质含量。从热带种质中引入高蛋白质等位基因到高梁育种系列中将需要同时选择两个性状。

具有最高蛋白质含量的这16个种质可以作为育种计划中父本系的候选。guinea种族最初来自西非，与谷粒霉抗性和多种真菌引起的疾病有关。种子品质可能对蛋白质含量产生显著影响。

本次筛选中使用的大多数种质都具有较高的种子品质（通过目视检查确定），因此蛋白质含量不应受到过多影响。此次的样本数量（200）和多年的评估为鉴定具有一致较高蛋白质含量的种质提供了适当的方法。

观察到的高遗传力表明，为了选择具有一致较高蛋白质含量的种质，育种计划中对蛋白质含量的筛选和选择可能需要至少三个“环境”（地点或年份）。尽管评估的种质没有包括所有高梁种族的完整代表，但guinea种族中可能包含比caudatum和kafir种族中更高频率的高蛋白质等位基因。

对SAP的谷物组成分析表明，大部分kafir种质群中的蛋白质含量最低，对NPGS种质收藏或选定的多样性群体的进一步筛选将有助于了解高梁的驯化过程如何对谷物蛋白质产生变异。

近红外光谱法是一种经济有效的方法，可用于无需研磨种子就能量化NPGS热带高梁种质集合的谷物蛋白质含量。对NPGS子集中的228个种质进行评估发现，有16个种质在多年的评估中一直具有较高的蛋白质含量。

这16个种质可用于育种计划，以开发具有改善营养特性的新品种。对NPGS高梁种质集合的进一步筛选将鉴定出更多高蛋白质含量的种质，并为育种过程中对谷物蛋白质变异的影响提供更多见解。